Presencia del Virus del Nilo Occidental en Equinos (Equus caballus) de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
M.V.Z. Roberto Coello Peralta
Presence of West Nile Virus in Horses (Equus caballus) in two
wetlands in the province of the Ríos, 2007 to 2009
Resumen
Con el propósito de conocer la presencia del Virus del Nilo Occidental (VNO) en Equinos del Ecuador se investigó en: Las Abras de Mantequilla y Jauneche. Para la temática de esta inves- tigación primero se realizó un censo de la población equina en las zonas a estudiar qué fue de 273 animales. Luego se tomaron las muestras, para después ser procesadas en el Subproceso de Virología del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez” para la determinación de anticuerpos contra el VNO mediante la técnica de ELISA. Las muestras reactivas por ELISA fueron enviadas al CDC de Puerto Rico para ser confirmadas por la prueba de Neutralización por Reducción del Número de Placas (NTRP). De las 189 muestras analizadas, 15 resultaron reactivas por la técnica de ELISA de ellas 5 se confirmaron por NTRP.
Palabras clave: Virus del Nilo Occidental, ELISA, NTRP
Summary
In orden to know the presence of West Nile Virus (WNV) in horses of Ecuador. Was investigated in: The Abras de Mantequilla and Jauneche. For the theme of this research is first conducted a census of the equine population in the areas studied, which was 273 animals. Then the samples were taken, later to be processed on the thread of Virology, National Institute of Hygiene and Tropical Medicine “Leopoldo Izquieta Perez” for the determination of antibodies to WNV by ELI - SA. The reactive samples were sent to the CDC in Puerto Rico to be confirmed by neutralization test by reducing the number of plates (NTRP). Of the 189 samples tested, 15 were reactive by ELISA of which 5 were confirmed by (NTRP).
Key words: West Nile Virus, ELISA, NTRP.
Revista de la Universidad de Guayaquil Nº 111, Agosto - Diciembre 2011, pp. 15 - 22 ISSN 1019 - 6161
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INVESTIGACIÓN
Introducción
La Fiebre del Oeste del Nilo (FON) forma parte del grupo de enfermedades conocidas como ar- bovirosis y es causada por el Virus del Nilo Occi- dental perteneciente al complejo antigénico de la Encefalitis Japonesa, del género Flavivirus de la familia Flaviridae (1, 18, 25, 27). Ver Fig. 1
La enfermedad causada por el VNO es una zoonosis cuyo reservorio son las aves y su vector es un mosquito del género Culex; Sin embargo el hombre, el caballo y otros mamíferos como los lémures y los roedores también pueden ser infectados en forma indirecta o incidental, pues no forman parte del ciclo natural del virus (2, 25, 28). Ver Fig. 2.
Este virus estuvo ausente del hemisferio occi- dental hasta agosto de 1999 cuando se presentó una epidemia en la ciudad de Nueva York (3). En la actualidad, el VNO ha alcanzado propor- ciones epidémicas en todo el continente ameri- cano (3, 4, 5, 23, 24), y dadas sus condiciones ecológicas y los patrones migratorios de nume- rosas aves, este problema se ha diseminado en varios países en un lapso de tiempo muy breve. (1, 17). Ver. Fig. 3
El presente trabajo tiene una importancia tras- cendental, puesto que los equinos constituyen los animales centinelas u hospederos incidenta- les más susceptibles de la enfermedad, lo cual unido a la posibilidad latente del estableci- miento de un ciclo de transmisión en el Ecuador podría llevar a esta enfermedad a convertirse en un grave problema de salud animal y públi- ca. Por tal motivo la investigación del muestreo se desarrolló en los meses de septiembre a di- ciembre del 2007, puesto que en esos meses las aves migratorias se asientan en los dos hume- dales que se estudiaron. En el 2008 se realizó la prueba de ELISA; en el 2009 se confirmó y fue sustentada por el M.V.Z. Roberto Darwin Coello Peralta ante el tribunal asignado por el Institu- to Tecnológico Agropecuario de Vinces, previo a la obtención al título Técnico Médico Veterina- rio Zootecnista.
Las condiciones climatológicas y ecológicas del territorio ecuatoriano, la presencia del vector y la identificación de la presencia del VNO en países cercanos como Colombia, hacen de vi- tal importancia la investigación de este virus en Ecuador.
Figura 1. Virus del Nilo Occidental visto por Microscopía Electrónica.
Figura 2. Ciclo de Transmisión del irus del Nilo occiden- tal.
Figura 3. Presencia de Aves migratorias en el Humedal Abras de Mantequilla.
Figura 4. Animal sintomático con presencia del Virus del Nilo Occidental.
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Presencia del Virus del Nilo Occidental en Equinos de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
Número de equinos estudiados según recinto, sexo y edad, año 2007 al 2009.
Lugar
Machos Hembras Promedio de eda- des
Síntomas Total de animales
%
El Recuerdo 2 9 3.4 años Si 11 5.8
La Piedad 8 3 4.5 años No 11 5.8
La Luz 17 13 6.5 años No 30 15.9
Playones 4 7 7.1 años No 11 5.8
Mapancillo 26 25 5.3 años No 51 26.9
Jobo 7 11 4 años No 18 9.6
Destierro 12 10 6 años No 22 11.6
Jauneche 15 20 8.1 años Si 35 18.5
Cuadro 1.
Fuente: elaboración propia
Gráfico 1. Porcentajes de equinos estudiados durante el estudio.
Cuadro clínico
Al inicio de la enfermedad en humanos es súbito tras un período de incubación de 3 a 14 días y se caracteriza por un cuadro seudogripal con fie - bre moderada o alta, odinofagia, cefalea, lum- balgia, artralgias, mialgias y cansancio o fatiga de aproximadamente una semana de duración. Suele acompañarse de inyección conjuntival, erupción cutánea, adenopatías, faringitis, do- lor ocular, náuseas, vómitos y dolor abdominal (9, 10, 16, 20, 25). Habitualmente los síntomas son inespecíficos y de moderada intensidad (22, 23). En los casos graves el cuadro que predomi- na es la encefalitis y ocurre principalmente en personas mayores de cincuenta años. Se pre- senta con los síntomas inespecíficos junto con
rigidez de nuca, desorientación, debilidad mus- cular y coma (10, 16, 17, 20, 22). La mortalidad en los humanos asociada a la enfermedad varía del 3 a 15-30% especialmente en personas de edad avanzada (6,20).
La infección en los equinos suele ser asinto- mática, sin embargo hasta un 10% de los casos pueden presentar manifestaciones neurológicas de infección, como ataxia, paresia y parálisis de los miembros hasta llegar en algunos ca- sos hasta la reclinación. En ocasiones pueden aparecer fasciculaciones de piel, temblores y rigidez muscular. En los últimos brotes en los Estados Unidos se observó la aparición de otros síntomas como dismetría, somnolencia, hiper- estesia, hiperexcitabilidad e incluso conducta
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agresiva. La tasa de mortalidad en los equinos es variable y ronda entre el 38% - 57,1%. (11, 12, 13, 15). Ver Fig. 4
Materiales y Métodos
2.1 manejo del estudio
Se realizó un plan descriptivo en los humeda- les de Abras de Mantequilla y Jauneche de la Provincia de Los Ríos (7, 8). Se analizó un total de 189 muestras de suero provenientes de los humedales mencionados. De ellas, 180 eran de equinos y 9 muestras de humanos. Estas mues- tras fueron procesadas en el Subproceso de Vi- rología del Instituto Nacional de Higiene y Medi- cina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez” (INHMT “LIP”). Ver cuadro 1 y gráfico 5.
2.2 Obtención de muestras
Previo a la obtención de la muestra de sangre se explicó a los propietarios de los caballos so- bre los objetivos del estudio y luego se firmó un acta de consentimiento informado. Con el con- sentimiento del propietario se procedió a tomar la muestra de sangre, la misma que se realizó desde tempranas horas de la mañana cumplien- do las normas de bioseguridad indicadas para este tipo de trabajos puesto que se trata de una enfermedad zoonótica. Ver Fig. 5 y 6
2.3 Preparación y Análisis de muestras
Las muestras obtenidas fueron llevadas al INHMT “LIP” para la obtención del suero a utilizar y lue- go ser analizadas utilizando El kit diagnóstico de West Nile Virus IgM Capture ELISA de la casa Pan- Bio® (Ver Fig. 7). En el cual anticuerpos de tipo IgM de la muestra se combinan con anticuerpos anti-IgM unidos a pozos de poliestireno. Luego se coloca antígeno de VNO combinado con un anticuerpo monoclonal conjugado con peroxida- sa al cual posteriormente se añade un sustrato cromógeno el cual produce un cambio de color en la reacción. Finalmente se para la reacción al colocar un ácido débil. El desarrollo de color en la reacción es indicativo de la presencia de anticuerpos IgM contra el VNO (26).
Se colocan 100 uL del suero diluido (1:100) en los pozos de la placa y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Al mismo tiempo se prepara una mez- cla (a igual volumen) de anticuerpo monoclonal (Mab tracer) y antígeno de VNO. Luego se rea- lizan 6 lavados con la solución de lavado del kit comercial. Se añaden 100 uL de la mezcla anti- cuerpo monoclonal-antígeno y se deja incubar por 1 hora a 37ºC. Se lava 6 veces y posterior-
Figura 5. Toma de muestras en el sector de los Playones de las Abras de Mantequilla, año 2007 al 2009.
Figura 6. Bioseguridad: Colocacion de detán en el cuerpo del investigador, año 2007 al 2009.
Figura 7. Dilución de las muestras en el laboratorio, año 2007 al 2009.
mente se colocan 100 uL de solución TMB y se deja incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se añaden 100 uL de so- lución stop para terminar la reacción. Se lee la prueba a 450 nm en un lector de ELISA.
2.4 Prueba confirmatoria
La detección de anticuerpos IgM contra VON en una muestra sanguínea se consideró como caso probable de infección según las recomen- daciones para el diagnóstico de VON de la OMS (19, 21, 24). Por esta razón, todas las mues-
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tras reactivas con el método de ELISA fueron enviadas al Laboratorio de la División de Enfer- medades Infecciosas Transmitidas por Vectores del Centro de Control y Prevención de Enfer- medades de Puerto Rico. (CDC por sus siglas en inglés) para que sean analizadas por la técnica de neutralización por reducción del número de placas (NTRP) con el objeto de confirmar los resultados obtenidos.
En esta técnica se utilizan diferentes dilucio- nes del suero a estudiar junto con una dilución constante de virus. Se utilizan células BHK-21 en las cuales se colocan diluciones de los sue- ros a estudiar utilizando como diluyente medio celular HANK + suero fetal bovino al 2%; luego se coloca VNO que tenga un título viral de 15 – 20 UFP/50 uL, se homogeniza la mezcla virus- suero en una placa de 24 pozos y se dejan en incubación durante 4 horas a una temperatura de 37ºC a una atmósfera de 5% de CO2 junto con controles de virus, luego de lo cual se aña- de medio overlay para dejarlo en incubación a 37ºC con 5% de CO2 por una semana. Finalmen- te se tiñen las células con Naftol Blue Black por 30 minutos y luego se lava el excedente. El cál-
culo del título de anticuerpos de la muestra se hace de la siguiente manera: Primeramente se calcula el promedio del número de placas en el pozo control de virus y luego se calcula el por- centaje de reducción de placas en los pozos con la mezcla virus/suero con respecto al promedio del pozo control de virus.
2.5 Materiales utilizados
A) de campo: Sogas, Vacutainer, Gradilla de plástico, Campana de extracción de sangre, Hieleras, Tijeras, Bolígrafos, Detán, Algodón, Alcohol, Cajas térmicas, Bandejas, Tablero con registro, etc
B) de laboratorio:
ELISA de captura IgM (PanBio): Micro pocillos sensibilizados con anticuerpos anti IgM, Antíge- no virus del Nilo Occidental (cepa NY99), Buffer de lavado, Diluyente de suero, Anticuerpo mo- noclonal conjugado con per oxidasa, Sustrato de tetrametilbencidina, Suero control positivo, Suero control negativo, Suero calibrador, Solu- ción de parada (Stop).
Muestras reactivas para anticuerpos IgM anti-VNO por ELISA, año 2007 al 2009.
Códig d Laborat
Especie Sexo
E d a d (años)
Humedal Recinto
Sínto- mas
Traslado a otras zonas
%
11 A E. Caballus Macho 8 A. Manteq La Piedad No No 20
12 A E. Caballus Macho 7 A. Manteq La Piedad No No
14 A E. Caballus Macho 5 A. Manteq La Piedad No No
36 A E. Caballus Macho 2 A. Manteq La luz No No 26.6
38 A E. Caballus Macho 5 A. Manteq La luz No No
44 A E. Caballus Hembra 3 A. Manteq La luz No No
B 10 E. Caballus Hembra 4 A. Manteq La luz No No
52 A E. Caballus Macho 14 A. Manteq Playones No No 6.7
64 A E. Caballus Macho 4 A. Manteq Mapancillo No No 20
67 A E. Caballus Hembra 3 A. Manteq Mapancillo No No
85 A E. Caballus Hembra 15 A. Manteq Mapancillo No No
108 A E. Caballus Macho 3 A. Manteq Jobo No No 6.7
8 J E. Caballus Macho 10 Jauneche T. Baldíos Si Si 20
17 J E. Caballus Macho 1 Jauneche Las Tablas No No
26 J E. Caballus Macho 20 Jauneche P. Central No No
Cuadro 2.
Fuente: elaboración propia
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Muestras confirmadas para anticuerpos IgM anti-VNO por ELISA, año 2007 al 2009.
Código de laboratorio
Especie Sexo
E d a d (años)
Humedal
Recinto Sínto- mas
Viajes a otras zonas
12
E. caballus Macho
7
Abras de Man- tequilla
La Piedad Ninguno No
14
E. caballus Macho
5
Abras de Man- tequilla
La Piedad Ninguno No
36
E. caballus Macho
2
Abras de Man- tequilla
La Luz
Ninguno No
93
E. caballus Macho
2
Abras de Man- tequilla
Mapanci- llo
Ninguno No
B10
E. caballus Hembra 6
Abras de Man- tequilla
La Luz
Ninguno No
Cuadro 3.
Fuente: elaboración propia
Neutralización por reducción del número de placas (NTRP): células BHK – 21, placas micro- titer, revestimiento de agarosa, médio celular nutritivo (HANK), suero fetal bovino, medio overlay, Naftol Blue Black, agua ultra pura, suero, virus sintético, incubadora de CO2 al 5%, pipetas, puntas de 1000 y 200 uL, frascos estériles.
Resultados
De las 189 muestras analizadas, 15 resultaron reactivas (7,9%) y 20 indeterminadas (10.5%) para anticuerpos tipo IgM contra el VON por la técnica de ELISA. (Ver cuadro 2) Las muestras reactivas fueron testadas por NTRP para confirmar la pre - sencia de los anticuerpos, encontrándose un total de 5 casos confirmados (Ver cuadro 3).
Se analizaron 9 muestras de humanos de las cuales 2 presentaron reactividad por la técnica de ELISA para anticuerpos contra VON (22,2%). Ninguna de ellas fue confirmada por NTRP.
Discusión
En el presente trabajo se obtuvo la evidencia se- rológica de circulación de VNO en los humedales de Abras de Mantequilla y Jauneche en la Pro- vincia de Los Ríos, constituyéndose en el primer reporte de la presencia del virus en el Ecuador. La zona estudiada es una de las rutas que siguen las aves en su migración durante la época fría en los países de Norteamérica, lo cual constituye un
factor de riesgo para la transmisión de diversos tipos de microorganismos en esa zona. Ver Fig. 3
Países como Argentina han reportado aislamien- to de VNO en muestras de cerebro de equinos con síntomas de la enfermedad (14). Las mues- tras recolectadas para la ejecución de este tra- bajo provinieron de equinos que no presentaban signos ni síntomas de enfermedad, lo cual no permitió tomar muestras para intentar aislar el virus, lo cual hubiera permitido realizar estudios moleculares que indicarían el origen geográfico de la cepa viral que infectó a los equinos estu- diados.
En países como Argentina, Cuba y Estados Unidos se ha reportado infección en humanos por este virus, sobre todo en los Estados Unidos en donde ha llegado a considerarse una enfermedad pre- valente. En este estudio no se confirmó infec - ción en personas, tal vez por el escaso número estudiado. Sin embargo, se observó reactividad en la prueba de ELISA contra VNO, lo cual pue- de haber ocurrido debido a la intensa reacción cruzada existente entre los diferentes tipos de flavivirus como el dengue, encefalitis de San Luis y otros arbovirus en general. Consideramos que debe estudiarse un mayor número de personas para esclarecer el grado de infección en huma- nos que el virus ha causado en las zonas anali- zadas.
Las aves constituyen el principal reservorio del virus. La complejidad en la metodología nece-
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saria para realizar la captura de aves y el pos- terior procesamiento de las mismas, hizo que en este trabajo piloto no se realizara muestreo de este reservorio. Sin embargo en países como Co- lombia y Cuba (21) han demostrado presencia de anticuerpos contra el virus en diferentes tipos de aves. En futuros estudios es necesario tomar en cuenta este punto para clarificar y conocer los tipos de aves involucradas en la cadena de transmisión del VNO en el Ecuador.
Los anticuerpos IgM anti VNO encontrados en los equinos estudiados indican que la infección con el virus es reciente, puesto que estos anticuer- pos pueden permanecer detectables en sangre por un tiempo de hasta 3 años después de la in- fección (2). Esto nos puede indicar que la entra- da del virus al país se dio en estos últimos tres años. Deben ampliarse el estudio a otros hume- dales del país para confirmar o descartar esta hipótesis.
Este trabajo constituye un estudio piloto el cual permitió obtener la evidencia serológica de la presencia de un nuevo virus en el Ecuador. Para conocer mejor la epidemiología, su ciclo de transmisión y las especies involucradas en el mismo debe realizarse estudios más grandes no sólo en los humedales de la Provincia de Los Ríos sino en otras regiones del país. De igual forma, el análisis de muestras humanas es necesario para esclarecer el grado de diseminación en hu- manos del VNO.
Los resultados de este trabajo constituyen un primer paso en el estudio del VNO en el Ecuador.
Las investigaciones derivadas del mismo permi- tirán conocer mejor al virus y su interacción con nuestro ecosistema y población, permitiendo a las autoridades de salud fortalecer los sistemas de vigilancia epidemiológica para beneficio de toda la sociedad ecuatoriana.
Conclusiones
1. Se obtuvo evidencia serológica de presen- cia de Virus del Nilo Occidental en equinos de los Humedales de Abras de Mantequilla y Jauneche en la Provincia de Los Ríos. 2. No se encontraron anticuerpos para este vi- rus en las personas estudiadas, además fue un equipo para extraer muestras en personas de dicho sectores.
Recomendaciones
1. Realizar estudios más amplios en estos hu- medales y en otras zonas del país que sean ruta de las aves migratorias.
2. Realizar estudios en los cuales se investiguen las aves y los mosquitos vectores de esta en- fermedad emergente tropical.
3. Alertar a las autoridades de salud los hallaz- gos de este trabajo con el fin de implementar un sistema de vigilancia epidemiológica.
4. Difundir los resultados obtenidos a la comu- nidad médica, científica y la sociedad en ge - neral.
5. Hacer periódicamente vigilancia epidemio- lógica en caballos y perros (animales centi- nelas) y humanos para establecer la circula- ción de este virus.
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M.V.Z. Roberto Coello Peralta
Egresado de la Maestría en Microbiología con mención Biomédica.
Telf: 088428659 – 052790274.
E-mail: rdcoello@hotmail.com
Dr. Carlos Mosquera Martínez.
Jefe del Departamento de Microbiología del INH Y MT “LIP”.
Docente de la Facultad de Ciencias Médicas. Jefe de Cátedra de Virología.
Telf: 099955239
E-mail: carlosmosquera.lv@gmail.com
Dr. Manuel González González.
Jefe del Departamento de Investigación y Docencia del INH Y MT “LIP”.
Docente de la Universidad Católica de Guayaquil.
Telf: 097426055
E-mail: manuel_gonzalezg@yahoo.com
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