Presencia del Virus del Nilo Occidental en
Equinos (Equus caballus) de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007
al 2009
Presence of West Nile
Virus in Horses (Equus caballus) in two wetlands in the province of the Ríos,
2007 to 2009
Roberto Coello Peralta
Carlos Mosquera Martínez
Manuel González González
Presencia del virus del Nilo occidental en
equinos (Equus caballus) de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007
al 2009
Presence of west Nile
virus in horses (Equus caballus) in two wetlands in the province of the Ríos,
2007 to 2009
Roberto Coello Peralta,Carlos
Mosquera Martínez, Manuel González González
Como
citar:
Coello Peralta, R., Mosquera Martínez, C., & González González, M. (2011).
Presencia del virus del Nilo occidental en equinos (Equus caballus) de dos
humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009. Revista Universidad
De Guayaquil, 111(2), 15–22. DOI: https://doi.org/10.53591/rug.v111i2.457
Resumen
Con el propósito
de conocer la presencia del Virus del Nilo Occidental (VNO) en Equinos
del Ecuador se investigó en:
Las Abras de Mantequilla y Jauneche. Para la temática de esta investigación primero
se realizó un censo de la población equina en las zonas a estudiar qué fue de 273
animales. Luego se tomaron las muestras, para después ser procesadas en el
Subproceso de Virología del Instituto Nacional
de Higiene y Medicina Tropical
“Leopoldo Izquieta Pérez”
para la determinación de anticuerpos contra el VNO mediante la técnica de ELISA. Las muestras reactivas
por ELISA fueron
enviadas al CDC de Puerto
Rico para ser confirmadas por la prueba
de Neutralización por Reducción del Número de Placas (NTRP).
De las 189 muestras analizadas, 15 resultaron reactivas
por la técnica de ELISA de ellas 5 se confirmaron por NTRP.
Palabras clave: Virus del Nilo Occidental, ELISA, NTRP
Summary
In orden to know the presence of West Nile Virus (WNV) in horses
of Ecuador. Was investigated in: The Abras de Mantequilla and
Jauneche. For the theme of this research is first conducted a census of the equine population in the
areas studied, which was 273 animals. Then the samples were taken, later to be processed on the thread of Virology,
National Institute of Hygiene and Tropical Medicine
“Leopoldo Izquieta Perez” for the determination of antibodies to WNV by ELI- SA. The reactive
samples were sent to the CDC in Puerto Rico to be confirmed by neutralization test by reducing
the number of plates (NTRP).
Of the 189 samples tested,
15 were reactive
by ELISA of which 5 were confirmed by (NTRP).
Key words: West Nile Virus,
ELISA, NTRP.
Introducción
La
Fiebre del Oeste del Nilo (FON) forma parte del
grupo de enfermedades conocidas como arbovirosis y es causada por el Virus del
Nilo Occidental perteneciente al complejo antigénico de la Encefalitis Japonesa, del género Flavivirus de la familia Flaviridae (1, 18, 25, 27). Ver Fig. 1
La enfermedad causada por el VNO es una zoonosis cuyo reservorio son las aves y su
vector es un mosquito del género Culex;
Sin embargo, el hombre, el caballo y otros mamíferos
como los lémures y los roedores
también pueden ser infectados en
forma indirecta o incidental, pues no
forman parte del ciclo natural del virus (2,
25, 28). Ver Fig. 2.
Este
virus estuvo ausente del hemisferio occidental hasta agosto de 1999 cuando se
presentó una epidemia en la ciudad
de Nueva York (3). En la actualidad, el VNO ha alcanzado
proporciones epidémicas en todo el continente americano (3, 4, 5, 23, 24), y
dadas sus condiciones ecológicas y los
patrones migratorios de numerosas aves, este problema se ha diseminado en varios países en un lapso de tiempo muy
breve. (1, 17). Ver. Fig. 3
El
presente trabajo tiene una importancia trascendental, puesto que los equinos
constituyen los animales centinelas u
hospederos incidentales más susceptibles de la enfermedad, lo cual unido a la posibilidad latente
del establecimiento de un
ciclo de transmisión en el Ecuador podría llevar
a esta enfermedad a convertirse en un grave problema de salud animal y pública. Por tal motivo
la investigación del muestreo se
desarrolló en los meses de septiembre a diciembre del 2007, puesto que en esos
meses las aves migratorias se
asientan en los dos hume- dales que
se estudiaron. En el 2008 se realizó la prueba
de ELISA; en el 2009 se confirmó y fue sustentada
por el M.V.Z. Roberto Darwin Coello Peralta
ante el tribunal asignado por el
Instituto Tecnológico Agropecuario de Vinces, previo a la obtención al título Técnico Médico Veterinario Zootecnista.
Las
condiciones climatológicas y ecológicas del territorio ecuatoriano, la presencia del vector y la identificación de la presencia del
VNO en países cercanos como Colombia,
hacen de vital
importancia la investigación de este virus en Ecuador.
Figura 1. Virus del Nilo Occidental visto por Microscopía Electrónica.
Figura
2. Ciclo de Transmisión del virus del Nilo occidental.
Figura 3. Presencia de Aves migratorias en el Humedal
Abras de Mantequilla.
Figura 4. Animal sintomático con presencia del Virus del Nilo Occidental.
|
|
Número de equinos estudiados
según recinto, sexo y edad, año 2007 al 2009.
|
|
|
Lugar
|
Machos
|
Hembras
|
Promedio de edades
|
Síntomas
|
Total de animales
|
%
|
|
El Recuerdo
|
2
|
9
|
3.4 años
|
Si
|
11
|
5.8
|
|
La Piedad
|
8
|
3
|
4.5 años
|
No
|
11
|
5.8
|
|
La Luz
|
17
|
13
|
6.5 años
|
No
|
30
|
15.9
|
|
Playones
|
4
|
7
|
7.1 años
|
No
|
11
|
5.8
|
|
Mapancillo
|
26
|
25
|
5.3 años
|
No
|
51
|
26.9
|
|
Jobo
|
7
|
11
|
4 años
|
No
|
18
|
9.6
|
|
Destierro
|
12
|
10
|
6 años
|
No
|
22
|
11.6
|
|
Jauneche
|
15
|
20
|
8.1 años
|
Si
|
35
|
18.5
|
|
Cuadro 1.
Fuente: elaboración propia
|
Cuadro clínico
Al inicio
de la enfermedad en humanos
es súbito tras un período
de incubación de 3 a 14 días y se caracteriza
por un cuadro seudogripal con fiebre moderada o alta, odinofagia, cefalea, lumbalgia,
artralgias, mialgias y cansancio o fatiga de
aproximadamente una semana de duración. Suele acompañarse de inyección conjuntival, erupción cutánea, adenopatías, faringitis, dolor ocular,
náuseas, vómitos y dolor abdominal (9,
10, 16, 20, 25). Habitualmente los síntomas son
inespecíficos y de moderada intensidad (22,
23). En los casos graves el cuadro que predomina es la encefalitis y ocurre principalmente en personas mayores de cincuenta años. Se presenta con los síntomas
inespecíficos junto con
rigidez
de nuca, desorientación, debilidad muscular y coma (10, 16, 17, 20, 22). La
mortalidad en los humanos asociada a
la enfermedad varía del 3 a 15-30%
especialmente en personas de edad avanzada
(6,20).
La
infección en los equinos suele ser asintomática, sin embargo, hasta un 10% de
los casos pueden presentar
manifestaciones neurológicas de infección, como ataxia, paresia
y parálisis de los miembros
hasta llegar en algunos casos hasta la reclinación. En ocasiones pueden aparecer fasciculaciones de piel,
temblores y rigidez muscular. En los
últimos brotes en los Estados Unidos
se observó la aparición de otros síntomas
como dismetría, somnolencia, hiperestesia, hiperexcitabilidad e incluso conducta
agresiva.
La tasa de mortalidad en los equinos es
variable y ronda entre el 38% - 57,1%. (11, 12, 13, 15). Ver Fig. 4
Materiales y Métodos
2.1 manejo del estudio
Se realizó
un plan descriptivo en los humedales de Abras de Mantequilla y
Jauneche de la Provincia de Los Ríos
(7, 8). Se analizó un total de 189
muestras de suero provenientes de los humedales
mencionados. De ellas, 180 eran de equinos
y 9 muestras de humanos. Estas mues- tras
fueron procesadas en el Subproceso de Virología del Instituto Nacional de
Higiene y Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez” (INHMT “LIP”).
Ver cuadro 1 y gráfico
5.
2.2 Obtención de muestras
Previo a la obtención
de la muestra de sangre
se explicó a los propietarios de los caballos sobre los objetivos del
estudio y luego se firmó un acta de
consentimiento informado. Con el consentimiento del propietario se procedió a
tomar la muestra de sangre, la misma
que se realizó desde tempranas horas
de la mañana cumpliendo las normas de bioseguridad indicadas para este tipo de trabajos puesto
que se trata de una enfermedad zoonótica.
Ver Fig. 5 y 6
2.3 Preparación y Análisis de muestras Las muestras obtenidas fueron llevadas al INHMT “LIP”
para la obtención del suero a utilizar y luego ser analizadas utilizando El kit diagnóstico de West Nile Virus IgM Capture
ELISA de la casa Pan- Bio® (Ver Fig. 7). En el cual
anticuerpos de tipo IgM de la
muestra se combinan con anticuerpos anti-IgM unidos
a pozos de poliestireno. Luego
se coloca antígeno de VNO combinado con un anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa al cual posteriormente se añade un
sustrato cromógeno el cual produce un
cambio de color en la reacción. Finalmente, se para la reacción al colocar un ácido débil. El desarrollo
de color en la reacción es indicativo
de la presencia de anticuerpos IgM contra el VNO (26).
Se
colocan 100 uL del suero diluido (1:100) en los
pozos de la placa y se incuba a 37ºC durante
1 hora. Al mismo tiempo se prepara una mezcla (a igual volumen) de
anticuerpo monoclonal (Mab tracer) y
antígeno de VNO. Luego se realizan 6 lavados con la solución de lavado del kit comercial. Se añaden 100 uL de la mezcla
anticuerpo monoclonal-antígeno y se deja incubar por 1 hora a 37ºC. Se lava 6 veces y posteriormente
Figura
5. Toma de muestras
en el sector de los Playones de las Abras
de Mantequilla, año 2007 al 2009.
Figura 6. Bioseguridad: Colocacion de detán en el cuerpo del investigador, año 2007 al 2009.
Figura 7. Dilución de las muestras en
el laboratorio, año 2007 al 2009.
se
colocan 100 uL de solución TMB y se deja
incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Finalmente se añaden 100 uL de solución stop para terminar la reacción. Se lee
la prueba a 450 nm en un lector de ELISA.
2.4 Prueba confirmatoria
La detección
de anticuerpos IgM contra VON en
una muestra sanguínea se consideró como caso
probable de infección según las recomen- daciones
para el diagnóstico de VON de la OMS (19, 21, 24). Por esta razón,
todas las muestras reactivas con
el
método de ELISA fue enviadas al Laboratorio
de la División de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por Vectores del Centro de Control y Prevención de
Enfermedades de Puerto Rico. (CDC por sus siglas en inglés) para que sean analizadas por la técnica de neutralización por reducción del número
de placas (NTRP) con el objeto de
confirmar los resultados obtenidos.
En
esta técnica se utilizan diferentes diluciones del suero a estudiar junto con
una dilución constante de virus. Se utilizan células
BHK-21 en las cuales se
colocan diluciones de los sueros a estudiar utilizando como diluyente medio celular
HANK + suero fetal bovino
al 2%; luego se coloca
VNO que tenga
un título viral
de 15
–
20 UFP/50 uL, se homogeniza la mezcla virus-
suero en una placa de 24 pozos y se dejan en incubación durante 4 horas a una temperatura de 37ºC a una atmósfera
de 5% de CO2 junto
con controles de virus, luego de lo cual se aña- de medio overlay para dejarlo en incubación a 37ºC con 5% de CO2 por una semana.
Finalmente se tiñen las células con Naftol Blue Black por 30 minutos y luego se lava el excedente.
El calculo del título de anticuerpos de la muestra se hace de la siguiente manera: Primeramente,
se calcula el promedio del número de
placas en el pozo control de virus y
luego se calcula el porcentaje de reducción de placas en los pozos con la mezcla virus/suero con respecto al
promedio del pozo control de virus.
2.5 Materiales utilizados
A)
de campo: Sogas, Vacutainer, Gradilla de
plástico, Campana de extracción de sangre, Hieleras,
Tijeras, Bolígrafos, Detán, Algodón, Alcohol, Cajas térmicas, Bandejas, Tablero con registro,
etc
B) de laboratorio:
ELISA
de captura IgM (PanBio): Micro pocillos sensibilizados
con anticuerpos anti IgM, Antígeno virus del Nilo Occidental (cepa NY99),
Buffer de lavado, Diluyente de
suero, Anticuerpo monoclonal conjugado con per oxidasa,
Sustrato de
tetrametilbencidina, Suero control positivo,
Suero control negativo, Suero calibrador, Solución de parada (Stop).
|
Muestras reactivas para anticuerpos IgM
anti-VNO por ELISA,
año 2007 al 2009.
|
|
Códig d Laborat
|
Especie
|
Sexo
|
Edad (años)
|
Humedal
|
Recinto
|
Síntomas
|
Traslado a otras
zonas
|
%
|
|
11 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
8
|
A.
Manteq
|
La
Piedad
|
No
|
No
|
20
|
|
12 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
7
|
A.
Manteq
|
La
Piedad
|
No
|
No
|
|
|
14 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
5
|
A.
Manteq
|
La
Piedad
|
No
|
No
|
|
|
36 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
2
|
A.
Manteq
|
La luz
|
No
|
No
|
26.6
|
|
38 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
5
|
A.
Manteq
|
La luz
|
No
|
No
|
|
|
44 A
|
E. Caballus
|
Hembra
|
3
|
A.
Manteq
|
La luz
|
No
|
No
|
|
|
B 10
|
E. Caballus
|
Hembra
|
4
|
A.
Manteq
|
La luz
|
No
|
No
|
|
|
52 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
14
|
A.
Manteq
|
Playones
|
No
|
No
|
6.7
|
|
64 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
4
|
A.
Manteq
|
Mapancillo
|
No
|
No
|
20
|
|
67 A
|
E. Caballus
|
Hembra
|
3
|
A.
Manteq
|
Mapancillo
|
No
|
No
|
|
|
85 A
|
E. Caballus
|
Hembra
|
15
|
A.
Manteq
|
Mapancillo
|
No
|
No
|
|
|
108 A
|
E. Caballus
|
Macho
|
3
|
A. Manteq
|
Jobo
|
No
|
No
|
6.7
|
|
8 J
|
E. Caballus
|
Macho
|
10
|
Jauneche
|
T. Baldíos
|
Si
|
Si
|
20
|
|
17 J
|
E. Caballus
|
Macho
|
1
|
Jauneche
|
Las Tablas
|
No
|
No
|
|
|
26 J
|
E. Caballus
|
Macho
|
20
|
Jauneche
|
P.
Central
|
No
|
No
|
|
|
Cuadro 2.
Fuente: elaboración propia
|
|
|
Muestras confirmadas para anticuerpos IgM
anti-VNO por ELISA,
año 2007 al 2009.
|
|
|
Código de laboratorio
|
Especie
|
Sexo
|
Ed ad (años)
|
Humedal
|
Recinto
|
Síntomas
|
Viajes a otras zonas
|
|
12
|
E. caballus
|
Macho
|
7
|
Abras de Mantequilla
|
La Piedad
|
Ninguno
|
No
|
|
14
|
E. caballus
|
Macho
|
5
|
Abras de Mantequilla
|
La Piedad
|
Ninguno
|
No
|
|
36
|
E. caballus
|
Macho
|
2
|
Abras de Mantequilla
|
La Luz
|
Ninguno
|
No
|
|
93
|
E. caballus
|
Macho
|
2
|
Abras de Mantequilla
|
Mapancillo
|
Ninguno
|
No
|
|
B10
|
E. caballus
|
Hembra
|
6
|
Abras de Mantequilla
|
La Luz
|
Ninguno
|
No
|
|
Cuadro 3.
Fuente: elaboración propia
|
Neutralización por reducción del número de placas
(NTRP): células BHK – 21, placas microtiter, revestimiento de agarosa, médio
celular nutritivo (HANK),
suero fetal bovino,
medio overlay, Naftol Blue Black, agua ultra pura, suero, virus sintético, incubadora de CO2 al 5%, pipetas, puntas de 1000 y 200 uL,
frascos estériles.
Resultados
De
las 189 muestras analizadas, 15 resultaron reactivas
(7,9%) y 20 indeterminadas (10.5%) para anticuerpos tipo IgM contra
el VON por la técnica
de ELISA. (Ver cuadro 2) Las muestras reactivas fueron testadas por NTRP para confirmar la presencia
de los anticuerpos, encontrándose un total de 5 casos confirmados (Ver cuadro 3).
Se
analizaron 9 muestras de humanos de las cuales
2 presentaron reactividad por la técnica de
ELISA para anticuerpos contra VON (22,2%). Ninguna de ellas fue confirmada por NTRP.
Discusión
En el presente trabajo
se obtuvo la evidencia serológica de circulación de VNO en los humedales de Abras de Mantequilla y Jauneche en la Provincia de Los Ríos,
constituyéndose en el primer reporte
de la presencia del virus en el Ecuador. La zona estudiada es una de las rutas que siguen
las aves en su migración durante la época fría en los países de Norteamérica, lo cual constituye un
factor
de riesgo para la transmisión de diversos tipos de microorganismos en esa zona. Ver Fig. 3
Países
como Argentina han reportado aislamiento de VNO en muestras de cerebro de
equinos con síntomas de la enfermedad
(14). Las muestras recolectadas para la ejecución de este trabajo provinieron
de equinos que no presentaban signos
ni síntomas de enfermedad, lo cual no permitió
tomar muestras para intentar aislar el virus, lo cual hubiera
permitido realizar estudios
moleculares que indicarían el origen geográfico de la cepa viral que infectó a los equinos estudiados.
En países como Argentina, Cuba
y Estados Unidos
se ha reportado infección en humanos por este virus, sobre todo en los Estados Unidos
en donde ha llegado a considerarse una enfermedad
prevalente. En este estudio no se confirmó infección en personas, tal vez por
el escaso número estudiado. Sin embargo, se observó reactividad en la prueba de ELISA contra VNO, lo cual
puede haber ocurrido debido a la intensa reacción cruzada existente entre los diferentes tipos de flavivirus como el dengue, encefalitis de San Luis y
otros arbovirus en general.
Consideramos que debe estudiarse un
mayor número de personas para esclarecer
el grado de infección en huma- nos
que el virus ha causado en las zonas analizadas.
Las
aves constituyen el principal reservorio del
virus. La complejidad en la metodología necesaria para
realizar
la captura de aves y el posterior procesamiento de las mismas,
hizo que en este
trabajo piloto no se realizara muestreo de este reservorio. Sin embargo, en países como Colombia y Cuba (21) han demostrado presencia de anticuerpos contra el virus en diferentes
tipos de aves. En futuros estudios es
necesario tomar en cuenta este punto
para clarificar y conocer los tipos
de aves involucradas en la cadena de transmisión del VNO en el Ecuador.
Los
anticuerpos IgM anti VNO encontrados en los
equinos estudiados indican que la infección con el virus es reciente, puesto que estos anticuerpos pueden
permanecer detectables en sangre por
un tiempo de hasta 3 años después de la infección (2). Esto nos puede indicar
que la entra- da del virus
al país se dio en estos últimos tres años.
Deben ampliarse el estudio a otros hume- dales
del país para confirmar o descartar esta hipótesis.
Este
trabajo constituye un estudio piloto el cual
permitió obtener la evidencia serológica de la presencia de un nuevo virus en el Ecuador. Para conocer
mejor la epidemiología, su ciclo de transmisión
y las especies involucradas en el mismo
debe realizarse estudios más grandes no sólo en los humedales de la Provincia de Los Ríos sino
en otras regiones del país. De igual forma, el
análisis de muestras humanas es necesario para
esclarecer el grado de diseminación en humanos
del VNO.
Los
resultados de este trabajo constituyen un primer paso en el estudio del VNO en el Ecuador.
Las
investigaciones derivadas del mismo permitirán
conocer mejor al virus y su interacción con nuestro
ecosistema y población, permitiendo a las
autoridades de salud fortalecer los
sistemas de vigilancia
epidemiológica para beneficio de toda la sociedad ecuatoriana.
Conclusiones
1. Se obtuvo evidencia serológica de presencia de Virus del Nilo
Occidental en equinos de los Humedales de Abras de Mantequilla y Jauneche en la Provincia de Los Ríos.
2. No se encontraron anticuerpos para este virus en las personas
estudiadas, además fue un equipo para extraer
muestras en personas
de dichos sectores.
Recomendaciones
1.
Realizar estudios más
amplios en estos humedales y en otras zonas del país que sean ruta de las aves migratorias.
2.
Realizar estudios en los cuales se investiguen las aves y los mosquitos
vectores de esta enfermedad emergente tropical.
3.
Alertar a las autoridades de salud los hallazgos de este trabajo
con el fin de implementar un sistema de vigilancia epidemiológica.
4.
Difundir los resultados
obtenidos a la comunidad médica, científica y la sociedad
en general.
5.
Hacer periódicamente
vigilancia epidemiológica en caballos y perros (animales centinelas) y humanos
para establecer la circulación de este virus.
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