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Revista Universidad de Guayaquil
Presencia del Virus del Nilo Occidental en
Equinos (Equus caballus) de dos humedales de la
Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
Presence of West Nile Virus in Horses (Equus caballus) in two
wetlands in the province of the Ríos, 2007 to 2009
Resumen
Con el propósito de conocer la presencia del Virus del Nilo Occidental (VNO) en Equinos del
Ecuador se investigó en: Las Abras de Mantequilla y Jauneche. Para la temática de esta inves-
tigación primero se realizó un censo de la población equina en las zonas a estudiar qué fue de
273 animales. Luego se tomaron las muestras, para después ser procesadas en el Subproceso de
Virología del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez” para
la determinación de anticuerpos contra el VNO mediante la técnica de ELISA. Las muestras
reactivas por ELISA fueron enviadas al CDC de Puerto Rico para ser confirmadas por la prueba
de Neutralización por Reducción del Número de Placas (NTRP). De las 189 muestras analizadas,
15 resultaron reactivas por la técnica de ELISA de ellas 5 se confirmaron por NTRP.
Palabras clave: Virus del Nilo Occidental, ELISA, NTRP
Summary
In orden to know the presence of West Nile Virus (WNV) in horses of Ecuador. Was investigated
in: The Abras de Mantequilla and Jauneche. For the theme of this research is rst conducted a
census of the equine population in the areas studied, which was 273 animals. Then the samples
were taken, later to be processed on the thread of Virology, National Institute of Hygiene and
Tropical Medicine “Leopoldo Izquieta Perez” for the determination of antibodies to WNV by ELI-
SA. The reactive samples were sent to the CDC in Puerto Rico to be conrmed by neutralization
test by reducing the number of plates (NTRP). Of the 189 samples tested, 15 were reactive by
ELISA of which 5 were conrmed by (NTRP).
Key words: West Nile Virus, ELISA, NTRP.
M.V.Z. Roberto Coello Peralta
Revista de la Universidad de Guayaquil
Nº 111, Agosto - Diciembre 2011, pp. 15 - 22
ISSN 1019 - 6161
16 Revista Universidad de Guayaquil
INVESTIGACIÓN
Introducción
La Fiebre del Oeste del Nilo (FON) forma parte
del grupo de enfermedades conocidas como ar-
bovirosis y es causada por el Virus del Nilo Occi-
dental perteneciente al complejo antigénico de
la Encefalitis Japonesa, del género Flavivirus de
la familia Flaviridae (1, 18, 25, 27). Ver Fig. 1
La enfermedad causada por el VNO es una
zoonosis cuyo reservorio son las aves y su vector
es un mosquito del género Culex; Sin embargo
el hombre, el caballo y otros mamíferos como
los lémures y los roedores también pueden ser
infectados en forma indirecta o incidental, pues
no forman parte del ciclo natural del virus (2,
25, 28). Ver Fig. 2.
Este virus estuvo ausente del hemisferio occi-
dental hasta agosto de 1999 cuando se presentó
una epidemia en la ciudad de Nueva York (3).
En la actualidad, el VNO ha alcanzado propor-
ciones epidémicas en todo el continente ameri-
cano (3, 4, 5, 23, 24), y dadas sus condiciones
ecológicas y los patrones migratorios de nume-
rosas aves, este problema se ha diseminado en
varios países en un lapso de tiempo muy breve.
(1, 17). Ver. Fig. 3
El presente trabajo tiene una importancia tras-
cendental, puesto que los equinos constituyen
los animales centinelas u hospederos incidenta-
les más susceptibles de la enfermedad, lo cual
unido a la posibilidad latente del estableci-
miento de un ciclo de transmisión en el Ecuador
podría llevar a esta enfermedad a convertirse
en un grave problema de salud animal y públi-
ca. Por tal motivo la investigación del muestreo
se desarrolló en los meses de septiembre a di-
ciembre del 2007, puesto que en esos meses las
aves migratorias se asientan en los dos hume-
dales que se estudiaron. En el 2008 se realizó la
prueba de ELISA; en el 2009 se conrmó y fue
sustentada por el M.V.Z. Roberto Darwin Coello
Peralta ante el tribunal asignado por el Institu-
to Tecnológico Agropecuario de Vinces, previo a
la obtención al título Técnico Médico Veterina-
rio Zootecnista.
Las condiciones climatológicas y ecológicas del
territorio ecuatoriano, la presencia del vector
y la identicación de la presencia del VNO en
países cercanos como Colombia, hacen de vi-
tal importancia la investigación de este virus
en Ecuador.
Figura 1. Virus del Nilo Occidental visto por Microscopía
Electrónica.
Figura 2. Ciclo de Transmisión del irus del Nilo occiden-
tal.
Figura 3. Presencia de Aves migratorias en el Humedal
Abras de Mantequilla.
Figura 4. Animal sintomático con presencia del Virus del
Nilo Occidental.
Revista Universidad de Guayaquil 17
Cuadro clínico
Al inicio de la enfermedad en humanos es súbito
tras un período de incubación de 3 a 14 días y se
caracteriza por un cuadro seudogripal con e-
bre moderada o alta, odinofagia, cefalea, lum-
balgia, artralgias, mialgias y cansancio o fatiga
de aproximadamente una semana de duración.
Suele acompañarse de inyección conjuntival,
erupción cutánea, adenopatías, faringitis, do-
lor ocular, náuseas, vómitos y dolor abdominal
(9, 10, 16, 20, 25). Habitualmente los síntomas
son inespecícos y de moderada intensidad (22,
23). En los casos graves el cuadro que predomi-
na es la encefalitis y ocurre principalmente en
personas mayores de cincuenta años. Se pre-
senta con los síntomas inespecícos junto con
rigidez de nuca, desorientación, debilidad mus-
cular y coma (10, 16, 17, 20, 22). La mortalidad
en los humanos asociada a la enfermedad varía
del 3 a 15-30% especialmente en personas de
edad avanzada (6,20).
La infección en los equinos suele ser asinto-
mática, sin embargo hasta un 10% de los casos
pueden presentar manifestaciones neurológicas
de infección, como ataxia, paresia y parálisis
de los miembros hasta llegar en algunos ca-
sos hasta la reclinación. En ocasiones pueden
aparecer fasciculaciones de piel, temblores y
rigidez muscular. En los últimos brotes en los
Estados Unidos se observó la aparición de otros
síntomas como dismetría, somnolencia, hiper-
estesia, hiperexcitabilidad e incluso conducta
Número de equinos estudiados según recinto, sexo y edad, año 2007 al
2009.
Lugar Machos
Hembras Promedio de eda-
des
Síntomas Total de
animales
%
El Recuerdo 2
9 3.4 años Si 11 5.8
La Piedad 8
3 4.5 años No 11 5.8
La Luz 17
13 6.5 años No 30 15.9
Playones 4
7 7.1 años No 11 5.8
Mapancillo 26
25 5.3 años No 51 26.9
Jobo 7
11 4 años No 18 9.6
Destierro 12
10 6 años No 22 11.6
Jauneche 15
20 8.1 años Si 35 18.5
Cuadro 1.
Gráco 1. Porcentajes de equinos estudiados durante el estudio.
Fuente: elaboración propia
Presencia del Virus del Nilo Occidental en Equinos de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
18 Revista Universidad de Guayaquil
INVESTIGACIÓN
agresiva. La tasa de mortalidad en los equinos
es variable y ronda entre el 38% - 57,1%. (11,
12, 13, 15). Ver Fig. 4
Materiales y Métodos
2.1 manejo del estudio
Se realizó un plan descriptivo en los humeda-
les de Abras de Mantequilla y Jauneche de la
Provincia de Los Ríos (7, 8). Se analizó un total
de 189 muestras de suero provenientes de los
humedales mencionados. De ellas, 180 eran de
equinos y 9 muestras de humanos. Estas mues-
tras fueron procesadas en el Subproceso de Vi-
rología del Instituto Nacional de Higiene y Medi-
cina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez” (INHMT
“LIP”). Ver cuadro 1 y gráco 5.
2.2 Obtención de muestras
Previo a la obtención de la muestra de sangre
se explicó a los propietarios de los caballos so-
bre los objetivos del estudio y luego se rmó un
acta de consentimiento informado. Con el con-
sentimiento del propietario se procedió a tomar
la muestra de sangre, la misma que se realizó
desde tempranas horas de la mañana cumplien-
do las normas de bioseguridad indicadas para
este tipo de trabajos puesto que se trata de una
enfermedad zoonótica. Ver Fig. 5 y 6
2.3 Preparación y Análisis de muestras
Las muestras obtenidas fueron llevadas al INHMT
“LIP” para la obtención del suero a utilizar y lue-
go ser analizadas utilizando El kit diagnóstico de
West Nile Virus IgM Capture ELISA de la casa Pan-
Bio® (Ver Fig. 7). En el cual anticuerpos de tipo
IgM de la muestra se combinan con anticuerpos
anti-IgM unidos a pozos de poliestireno. Luego
se coloca antígeno de VNO combinado con un
anticuerpo monoclonal conjugado con peroxida-
sa al cual posteriormente se añade un sustrato
cromógeno el cual produce un cambio de color
en la reacción. Finalmente se para la reacción
al colocar un ácido débil. El desarrollo de color
en la reacción es indicativo de la presencia de
anticuerpos IgM contra el VNO (26).
Se colocan 100 uL del suero diluido (1:100) en
los pozos de la placa y se incuba a 37ºC durante
1 hora. Al mismo tiempo se prepara una mez-
cla (a igual volumen) de anticuerpo monoclonal
(Mab tracer) y antígeno de VNO. Luego se rea-
lizan 6 lavados con la solución de lavado del kit
comercial. Se añaden 100 uL de la mezcla anti-
cuerpo monoclonal-antígeno y se deja incubar
por 1 hora a 37ºC. Se lava 6 veces y posterior-
mente se colocan 100 uL de solución TMB y se
deja incubar durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Finalmente se añaden 100 uL de so-
lución stop para terminar la reacción. Se lee la
prueba a 450 nm en un lector de ELISA.
2.4Pruebaconrmatoria
La detección de anticuerpos IgM contra VON
en una muestra sanguínea se consideró como
caso probable de infección según las recomen-
daciones para el diagnóstico de VON de la OMS
(19, 21, 24). Por esta razón, todas las mues-
Figura 5. Toma de muestras en el sector de los Playones de
las Abras de Mantequilla, año 2007 al 2009.
Figura 6. Bioseguridad: Colocacion de detán en el cuerpo
del investigador, año 2007 al 2009.
Figura 7. Dilución de las muestras en el laboratorio, año
2007 al 2009.
Revista Universidad de Guayaquil 19
tras reactivas con el método de ELISA fueron
enviadas al Laboratorio de la División de Enfer-
medades Infecciosas Transmitidas por Vectores
del Centro de Control y Prevención de Enfer-
medades de Puerto Rico. (CDC por sus siglas en
inglés) para que sean analizadas por la técnica
de neutralización por reducción del número de
placas (NTRP) con el objeto de conrmar los
resultados obtenidos.
En esta técnica se utilizan diferentes dilucio-
nes del suero a estudiar junto con una dilución
constante de virus. Se utilizan células BHK-21
en las cuales se colocan diluciones de los sue-
ros a estudiar utilizando como diluyente medio
celular HANK + suero fetal bovino al 2%; luego
se coloca VNO que tenga un título viral de 15
– 20 UFP/50 uL, se homogeniza la mezcla virus-
suero en una placa de 24 pozos y se dejan en
incubación durante 4 horas a una temperatura
de 37ºC a una atmósfera de 5% de CO2 junto
con controles de virus, luego de lo cual se aña-
de medio overlay para dejarlo en incubación a
37ºC con 5% de CO2 por una semana. Finalmen-
te se tiñen las células con Naftol Blue Black por
30 minutos y luego se lava el excedente. El cál-
culo del título de anticuerpos de la muestra se
hace de la siguiente manera: Primeramente se
calcula el promedio del número de placas en el
pozo control de virus y luego se calcula el por-
centaje de reducción de placas en los pozos con
la mezcla virus/suero con respecto al promedio
del pozo control de virus.
2.5 Materiales utilizados
A) de campo: Sogas, Vacutainer, Gradilla de
plástico, Campana de extracción de sangre,
Hieleras, Tijeras, Bolígrafos, Detán, Algodón,
Alcohol, Cajas térmicas, Bandejas, Tablero con
registro, etc
B) de laboratorio:
ELISA de captura IgM (PanBio): Micro pocillos
sensibilizados con anticuerpos anti IgM, Antíge-
no virus del Nilo Occidental (cepa NY99), Buffer
de lavado, Diluyente de suero, Anticuerpo mo-
noclonal conjugado con per oxidasa, Sustrato
de tetrametilbencidina, Suero control positivo,
Suero control negativo, Suero calibrador, Solu-
ción de parada (Stop).
MuestrasreactivasparaanticuerposIgManti-VNOporELISA,
año 2007 al 2009.
Códig d
Laborat
Especie
Sexo Edad
(años)
Humedal Recinto Sínto-
mas
Traslado a
otras zonas
%
11 A E. Caballus
Macho 8 A. Manteq La Piedad No No 20
12 A E. Caballus
Macho 7 A. Manteq La Piedad No No
14 A E. Caballus
Macho 5 A. Manteq La Piedad No No
36 A E. Caballus
Macho 2 A. Manteq La luz No No 26.6
38 A E. Caballus
Macho 5 A. Manteq La luz No No
44 A E. Caballus
Hembra 3 A. Manteq La luz No No
B 10 E. Caballus
Hembra 4 A. Manteq La luz No No
52 A E. Caballus
Macho 14 A. Manteq Playones No No 6.7
64 A E. Caballus Macho 4 A. Manteq Mapancillo No No 20
67 A E. Caballus Hembra 3 A. Manteq Mapancillo No No
85 A E. Caballus Hembra 15 A. Manteq Mapancillo No No
108 A E. Caballus Macho 3 A. Manteq Jobo No No 6.7
8 J E. Caballus Macho 10 Jauneche T. Baldíos Si Si 20
17 J E. Caballus Macho 1 Jauneche Las Tablas No No
26 J
E. Caballus Macho 20 Jauneche P. Central No No
Cuadro 2.
Fuente: elaboración propia
Presencia del Virus del Nilo Occidental en Equinos de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
20 Revista Universidad de Guayaquil
INVESTIGACIÓN
Neutralización por reducción del número de
placas (NTRP): células BHK – 21, placas micro-
titer, revestimiento de agarosa, médio celular
nutritivo (HANK), suero fetal bovino, medio
overlay, Naftol Blue Black, agua ultra pura,
suero, virus sintético, incubadora de CO2 al
5%, pipetas, puntas de 1000 y 200 uL, frascos
estériles.
Resultados
De las 189 muestras analizadas, 15 resultaron
reactivas (7,9%) y 20 indeterminadas (10.5%) para
anticuerpos tipo IgM contra el VON por la técnica
de ELISA. (Ver cuadro 2) Las muestras reactivas
fueron testadas por NTRP para conrmar la pre-
sencia de los anticuerpos, encontrándose un total
de 5 casos conrmados (Ver cuadro 3).
Se analizaron 9 muestras de humanos de las
cuales 2 presentaron reactividad por la técnica
de ELISA para anticuerpos contra VON (22,2%).
Ninguna de ellas fue conrmada por NTRP.
Discusión
En el presente trabajo se obtuvo la evidencia se-
rológica de circulación de VNO en los humedales
de Abras de Mantequilla y Jauneche en la Pro-
vincia de Los Ríos, constituyéndose en el primer
reporte de la presencia del virus en el Ecuador.
La zona estudiada es una de las rutas que siguen
las aves en su migración durante la época fría en
los países de Norteamérica, lo cual constituye un
factor de riesgo para la transmisión de diversos
tipos de microorganismos en esa zona. Ver Fig. 3
Países como Argentina han reportado aislamien-
to de VNO en muestras de cerebro de equinos
con síntomas de la enfermedad (14). Las mues-
tras recolectadas para la ejecución de este tra-
bajo provinieron de equinos que no presentaban
signos ni síntomas de enfermedad, lo cual no
permitió tomar muestras para intentar aislar el
virus, lo cual hubiera permitido realizar estudios
moleculares que indicarían el origen geográco
de la cepa viral que infectó a los equinos estu-
diados.
En países como Argentina, Cuba y Estados Unidos
se ha reportado infección en humanos por este
virus, sobre todo en los Estados Unidos en donde
ha llegado a considerarse una enfermedad pre-
valente. En este estudio no se conrmó infec-
ción en personas, tal vez por el escaso número
estudiado. Sin embargo, se observó reactividad
en la prueba de ELISA contra VNO, lo cual pue-
de haber ocurrido debido a la intensa reacción
cruzada existente entre los diferentes tipos de
avivirus como el dengue, encefalitis de San Luis
y otros arbovirus en general. Consideramos que
debe estudiarse un mayor número de personas
para esclarecer el grado de infección en huma-
nos que el virus ha causado en las zonas anali-
zadas.
Las aves constituyen el principal reservorio del
virus. La complejidad en la metodología nece-
MuestrasconrmadasparaanticuerposIgManti-VNOporELISA,
año 2007 al 2009.
Código de
laboratorio
Especie
Sexo Edad
(años)
Humedal Recinto Sínto-
mas
Viajes
a otras
zonas
12 E. caballus
Macho 7 Abras de Man-
tequilla
La Piedad Ninguno No
14 E. caballus
Macho 5 Abras de Man-
tequilla
La Piedad Ninguno No
36 E. caballus
Macho 2 Abras de Man-
tequilla
La Luz Ninguno No
93 E. caballus
Macho 2 Abras de Man-
tequilla
Mapanci-
llo
Ninguno No
B10 E. caballus
Hembra 6 Abras de Man-
tequilla
La Luz Ninguno No
Cuadro 3.
Fuente: elaboración propia
Revista Universidad de Guayaquil 21
saria para realizar la captura de aves y el pos-
terior procesamiento de las mismas, hizo que en
este trabajo piloto no se realizara muestreo de
este reservorio. Sin embargo en países como Co-
lombia y Cuba (21) han demostrado presencia de
anticuerpos contra el virus en diferentes tipos
de aves. En futuros estudios es necesario tomar
en cuenta este punto para claricar y conocer
los tipos de aves involucradas en la cadena de
transmisión del VNO en el Ecuador.
Los anticuerpos IgM anti VNO encontrados en los
equinos estudiados indican que la infección con
el virus es reciente, puesto que estos anticuer-
pos pueden permanecer detectables en sangre
por un tiempo de hasta 3 años después de la in-
fección (2). Esto nos puede indicar que la entra-
da del virus al país se dio en estos últimos tres
años. Deben ampliarse el estudio a otros hume-
dales del país para conrmar o descartar esta
hipótesis.
Este trabajo constituye un estudio piloto el cual
permitió obtener la evidencia serológica de la
presencia de un nuevo virus en el Ecuador. Para
conocer mejor la epidemiología, su ciclo de
transmisión y las especies involucradas en el
mismo debe realizarse estudios más grandes no
sólo en los humedales de la Provincia de Los Ríos
sino en otras regiones del país. De igual forma,
el análisis de muestras humanas es necesario
para esclarecer el grado de diseminación en hu-
manos del VNO.
Los resultados de este trabajo constituyen un
primer paso en el estudio del VNO en el Ecuador.
Las investigaciones derivadas del mismo permi-
tirán conocer mejor al virus y su interacción con
nuestro ecosistema y población, permitiendo a
las autoridades de salud fortalecer los sistemas
de vigilancia epidemiológica para benecio de
toda la sociedad ecuatoriana.
Conclusiones
1. Se obtuvo evidencia serológica de presen-
cia de Virus del Nilo Occidental en equinos
de los Humedales de Abras de Mantequilla
y Jauneche en la Provincia de Los Ríos.
2. No se encontraron anticuerpos para este vi-
rus en las personas estudiadas, además fue
un equipo para extraer muestras en personas
de dicho sectores.
Recomendaciones
1. Realizar estudios más amplios en estos hu-
medales y en otras zonas del país que sean
ruta de las aves migratorias.
2. Realizar estudios en los cuales se investiguen
las aves y los mosquitos vectores de esta en-
fermedad emergente tropical.
3. Alertar a las autoridades de salud los hallaz-
gos de este trabajo con el n de implementar
un sistema de vigilancia epidemiológica.
4. Difundir los resultados obtenidos a la comu-
nidad médica, cientíca y la sociedad en ge-
neral.
5. Hacer periódicamente vigilancia epidemio-
lógica en caballos y perros (animales centi-
nelas) y humanos para establecer la circula-
ción de este virus.
Bibliografía
1. Barriga G, Arumir C, Mercado F. (2002): Actualidades sobre la ebre del Nilo Occidental. Rev Mex Patol Clin
49 (4): pp 203 – 211. México
2. Burke D, Monath T. (2001): Flaviviruses. En: Knippe DM, Howley PM, editores. Fields Virology. Lippincott
Williams & Wilkins; pp. 1043 – 1125. EEUU.
3. Centers for Disease Control and Prevention. (1999): Outbreak of West Nile like viral encephalitis New York.
Morb Mortal Wkly Rep; 48: pp. 845 – 849. EEUU.
4. Campbell G, Marn A, Lanciotti R, Gubler D. (2002): West Nile Virus. Lancet Infect Dis; 2: pp 519 – 529. EEUU
5. Harrison T. (2002): West Nile Encephalitis. J Pediatr Health Care; 16: pp. 278 – 281. EEUU.
6. Izaguirre R, López L, Richard J, Mesa J, Herrera O. (2003): Infección por Virus del Nilo Occidental. Revista
de Especialidad Médico-Quirúrgicas; 8 (2): pp. 5 – 7. México.
7. Javier CASTILLO-OLIVARES*, James WOOD. (2004): West Nile virus infection of horses. Vet. Res. 35; pp.
467–483. EEUU.
8. Morales M, Barrandeguy M, Fabbri C, García J, Vissani A, Trono K, et al. (2006). West Nile Virus isolation from
equines in Argentina Emerging infectious diseases; 12 (10): dispacht.
Presencia del Virus del Nilo Occidental en Equinos de dos humedales de la Provincia de los Ríos, año 2007 al 2009
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INVESTIGACIÓN
M.V.Z. Roberto Coello Peralta
Egresado de la Maestría en Microbiología con mención Biomédica.
Telf: 088428659 – 052790274.
E-mail: rdcoello@hotmail.com
Dr. Carlos Mosquera Martínez.
Jefe del Departamento de Microbiología del INH Y MT “LIP”.
Docente de la Facultad de Ciencias Médicas. Jefe de Cátedra de Virología.
Telf: 099955239
E-mail: carlosmosquera.lv@gmail.com
Dr. Manuel González González.
Jefe del Departamento de Investigación y Docencia del INH Y MT “LIP”.
Docente de la Universidad Católica de Guayaquil.
Telf: 097426055
E-mail: manuel_gonzalezg@yahoo.com
9. Mattar S, Edwards E, Laguado J, Gonzalez M, Alvarez J, Komar N. (2005): West Nile Virus in Colombian hor-
ses. Emerging infectious diseases; 11 (9): pp. 1497 – 1498. Colombia.
10. Mandel G, Bennet J, Dolin R (2000): Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th Ed. Philadelphia:
Churchill Livingstone, EEUU.
11. Marn A, Gubler D. (2001): West Nile Encephalitis: an emerging disease in the United Status. CID; 33: pp.
1713 – 1719.
12. OPS/OMS/CDC. (2006): Taller sobre Vigilancia y Diagnóstico del Virus del Nilo Occidental. Pergamino, pp.
50. Argentina
13. Petersen L, Marn A. (2002): West Nile Virus: a primer for the clinician. Ann Intern Med 2002; 137: pp. 173
– 179. EEUU.
14. Soler D, Vera J. (2007): Intento de Detección del Virus del Oeste del Nilo en aves silvestres de San Andrés
Isla, Colombia. Universidad Nacional de Colombia – Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre. Colombia.
15. Sampson B, Ambrosi C, Charlot A, Reiber K, Veress J, Anmbrustmacher V. (2000): The pathology of human
West Nile Virus infection. Hum Pathol; 31: pp. 527 – 531. EEUU
16. Valles X, Sánchez F. West Nile virus: el virus de la ebre del Oeste del Nilo. Enf. Emerg. 2000; 2 (4): 232 –
238. España.
17. West Nile Virus IgM Capture ELISA. PanBio. EEUU.
Dr. Manuel Amunárriz, Dr. Segundo Quito, Dr.Víctor Tandazo
