ABSTRACT
Due to the high incidence of skin diseases such as seborrheic
dermatitis and the adverse reactions associated with medications used as
treatment for these disorders, the objective of this study is to evaluate the antifungal
activity of alcoholic extracts and essential oil from the leaves of Mentha
piperita against the fungus Malassezia furfur. The extraction procedures
consisted of maceration processes, drying at low temperatures and filtration of
the 70% alcoholic extract obtained from the leaves, as well as the steam drag
method where once the essence was condensed, it was collected and separated
from the aqueous fraction to obtain essential oil. The aura inhibitors of the
microorganism were determined by Kirby Bauer disc diffusion methodology, using
a pure strain of Malassezia furfur ATCC that was seeded in a homogeneous
suspension plate of the microorganism's lyophilisate, in Sabouraud Dextrose
Agar fortified with 10% extra virgin olive over a 7 days period, in incubation
at 30 ° C. The determination of the antifungal activity, dilutions was made at
different concentrations both for essential oil and the alcoholic extract, the
results were established by degrees of sensitivity. These results indicated
that the essential oils of Mentha piperita showed bigger aura inhibitors
against the microorganism M. furfur, the main cause of diseases such as
seborrheic dermatitis, in comparison with the alcoholic extracts.
Keywords: Mentha,
dermatitis, essential oil, Malassezia.
INTRODUCCIÓN
El presente trabajo de investigación abarca el
estudio de la actividad antifúngica que presentan los extractos alcohólicos y
el aceite esencial de la Mentha piperita frente al desarrollo de la
levadura Malassezia furfur principal causante de la caspa seborreica y
que además está asociada con otras formas de dermatitis. En las últimas décadas
se ha observado un incremento del uso de aceites esenciales provenientes de
plantas medicinales, para fines farmacéuticos.
La actividad antifúngica ha sido determinada en
base a la capacidad inhibitoria que posee el aceite esencial y extracto
alcohólico de las hojas de M.piperita frente al crecimiento de la
levadura Malassezia furfur. En esta investigación se estudian qué concentraciones
de los halos de inhibición resultan aptos para evitar el crecimiento de este
microorganismo, y cuáles metabolitos secundarios son los principales
responsables de este efecto.
Los métodos de análisis que hemos utilizado para
determinar la actividad antifúngica de M. piperita frente a M. furfur
consisten en el método de difusión de discos de Kirby-Bauer, el cual
implica un análisis de susceptibilidad para determinar la resistencia de
agentes patógenos aeróbicos y bacterias anaerobias facultativas frente a varios
compuestos antimicrobianos. Otros métodos utilizados durante esta investigación
se basan en procesos de desecación, filtración y maceración para la obtención
de los extractos hidroalcohólicos, y destilación por arrastre de vapor para la obtención
del aceite esencial.
METODOLOGIA
Esta investigación es de tipo experimental, in
vitro y exploratoria con enfoque cuantitativo, la cual se fundamentó en la
obtención de evidencias reales mediante el uso de las técnicas ya establecidas
con el propósito de determinar la actividad antifúngica del extracto alcohólico
y aceite esencial de las hojas de Mentha piperita. La muestra empleada en el
presente estudio de investigación son las hojas de Mentha piperita las cuales
fueron obtenidas en el Mercado Casuarina ubicado en la Av. Casuarina, norte de
Guayaquil. Esta planta fue elegida por su actividad positiva frente a Malassezia
furfur según revisiones bibliográficas.
Los criterios de inclusión fueron cepas puras de Malassezia
furfur sin contaminación, hojas de menta frescas, verdes, lisas sin daño
alguno, extracto alcohólico y aceite esencial de Mentha piperita en las
concentraciones de 12500ppm, 10500ppm, 8500ppm, 6500ppm, 4500ppm y 2500 ppm.
Procedimiento para la obtención del
extracto alcohólico al 70% de Mentha piperita (menta)
Se seleccionaron las mejores hojas de la planta de la menta
y se desecharon las hojas secas, quemadas, rotas, se lavaron con agua para la
eliminación de impurezas y se dejaron reposar con agua destilada durante diez
minutos. Las muestras húmedas fueron sometidas a un proceso de secado a bajas
temperaturas por largo períodos de tiempo.
Se realizaron los extractos hidroalcohólicos al
70% (Etanol G.R. J.T. Baker) por proceso de maceración del material seco
obtenido (10 g) luego del secado de 60°C por 36 horas, durante 48 horas y luego
se filtró por papel filtro Whatman para eliminar material extraño. El extracto
obtenido se llevó al rotavapor (Buchi) en el cual se eliminó el solvente del
extracto hasta su sequedad. Luego se llevó a volumen con Etanol G.R. y a partir
de este extracto se realizaron las diluciones.
Procedimiento para la obtención del aceite esencial de Mentha
piperita (menta)
La obtención del aceite esencial se realizó por
destilación por arrastre de vapor en el que la hojas frescas y cortadas en
trozos pequeños se encerraron en una trampa tipo Clevenger y se sometieron a
una corriente de vapor de agua sobrecalentado, luego de ser arrastrada se
condensa la esencia, se recolecta y se separa de la fracción acuosa, este
proceso tuvo una duración de tres horas.
Activación de Malassezia Furfur ATCC 14521 y difusión de discos
Se sembró por el método de dispersión en placa la
suspensión homogénea del liofilizado de Malassezia Furfur en Agar
Sabouraud Dextrosa con 10% de Aceite Oliva Extra Virgen, durante 7 días a 30°C
(incubación).
A partir de un cultivo de Malassezia furfur durante
7 días a 30ºC, se seleccionan 4 a 5 colonias y se prepara una suspensión en
solución estéril al 0,9% hasta alcanzar una concentración equivalente a 0,5
McFarland (1-5x106UFC/mL). Finalmente se realizó una difusión de los discos
tanto en aceite esencial como en extracto alcohólico de M.piperita los
cuales pasaron por un proceso de incubación que tardó 7 días, para
posteriormente analizar los resultados con respecto a los halos de inhibición
obtenidos. Se trabajó por cudrip
DESARROLLO
En el 2018 Lee Min Young y sus compañeros
llevaron a cabo un estudio in vitro y ensayo clínico con la finalidad de
evaluar el efecto inhibidor de diferentes extractos alcohólicos, aceites
esenciales naturales y extracto de fruta sobre las especies de Malassezia
furfur y Malassezia sympodialis midiendo la concentración mínima
inhibitoria (MIC), la concentración mínima fungicida (MFC) y utilizando el
método de difusión por disco, usando los extractos y aceite esencial de plantacomo
la menta, lavanda y romero, los resultados definieron que la actividad
antifúngica de los agentes de lavanda y cidra fue relativamente menor que los
de la menta en MIC Y MFC (1).
Los aceites esenciales están compuestos
principalmente de monoterpenos y sus derivados en proporciones del 76-90% pero
varían según la especie. En el caso de las proporciones de mentol y mentona del
aceite esencial, se encuentran en una proporción del 50% en Mentha piperita,
mientras que el terpenoide carvona se encuentra en 70% de aceite esencial
de hierbabuena o Mentha spicata (2).
La sociedad coreana de micología médica ha
definido a Malassezia furfur como una levadura dismórfica lipofílica que
forma parte de la mucosa normal de la piel humana y que además causante
principal de la caspa y dermatitis seborreica. También está asociada con otras
enfermedades como la pitiriasis versicolor, foliculitis por Malassezia,
dermatitis atópica y psoriasis (3).
La eficacia antifúngica de Mentha piperita fue
corroborada por Tullio Vivian et al. en el año 2019 en su estudio “Evaluación
de la actividad antifúngica del aceite esencial de Mentha piperita (Lamiaceae)
y su interacción sinérgica con los azoles” en donde se demostró que el aceite
esencial ejerce actividad fungicida contra levaduras del género Malassezia,
estableciendo que puede servir para el tratamiento en afecciones como la caspa
(4).
En 2017 Lee Jeong-Hyun comprobó la actividad anti Malassezia furfur y
Malassezia pachydermatis del limoneno (uno de los componentes del aceite
esencial de menta) revelando resultados positivos indicando que podría ser
potencialmente eficaz para controlar infecciones causadas por Malassezia
furfur (5).
Los diferentes estudios y referencias mencionadas
anteriormente, fueron comparados con los que se obtuvieron durante esta
investigación, obteniendo un resultado positivo en cuanto a la efectividad del
aceite esencial y extracto alcohólico frente al crecimiento de Malassezia
furfur. El aceite de Mentha piperita presentó un comportamiento
directamente proporcional al igual que los estudios pasados, siendo que a las
concentraciones de 2500 ppm, 4500 ppm, 6500 ppm y 8500 ppm fueron sensibles
frente al microorganismo.
Con respecto a los extractos alcohólicos de
Mentha piperita a la concentración de 5000 ppm este presentó actividad
antifúngica nula de acuerdo a Duraffourd. Mientras que, para las
concentraciones a partir de 10000, 20000, 30000, 40000 y 50000 ppm presentaron
sensibilidad límite.
RESULTADOS
En la tabla 1se muestran las medias de los halos
de inhibición (expresadas en mm) de las diferentes concentraciones (expresadas
en ppm) utilizadas en el ensayo del aceite esencial de Mentha piperita con
sus respectivas desviaciones estándar. El comportamiento del halo de inhibición
del aceite esencial de menta en la concentración de 2500 ppm fue de 9.25 mm
±0.50. Se apreció un crecimiento directamente proporcional con las
concentraciones de 4500 ppm, 6500 ppm y 8500 ppm obteniendo medias de 9,50 mm
±0.57, 10,75 mm ±0.50 y 11,50 mm ±0.50 respectivamente. Además, para las
concentraciones de 10500 ppm y 12500 ppm se obtuvieron medias de 15 mm y 15,50
mm considerándose dentro de la sensibilidad media de los aceites esenciales
según la escala de Duraffourd.
En la tabla 2 se presentan de la misma manera los
datos de las medias de halos de inhibición de las diferentes diluciones del
extracto alcohólico de Mentha piperita. A concentración de 5000 ppm este
presentó actividad antifúngica nula con una media de 4,5mm ±0.57, mientras que,
para las concentraciones de 10000 ppm, 20000 ppm, 30000 ppm, 40000 ppm y 50000
ppm con las medias respectivas de 9mm ±0, 9,25mm±0,50, 10,5mm ±0,57,
12,25mm±0,5, 13 mm±0.
DISCUSIÓN
La actividad antifúngica se demostró tanto en las
diferentes concentraciones del aceite esencial y extracto alcohólico de las
hojas de Mentha piperita siendo en concentraciones de 2500 ppm, 4500
ppm, 6500 ppm y 8500 ppm sensibles frente al microorganismo Malassezia
furfur ATCC 14521 según la actividad de los aceites esenciales de
Duraffourd y para las concentraciones de 10500 ppm y 12500 ppm de sensibilidad
media según Duraffourd para el aceite esencial, mientras que para el extracto
alcohólico las concentraciones que obtuvieron mayor halo de inhibición y
comprueban su actividad antifúngica fueron las de 10000 ppm, 20000 ppm, 30000
ppm, 40000 ppm y 50000 ppm. Por otra parte, la concentración de 5000 ppm fue la
única que presentó actividad nula lo que se atribuye a el tipo de muestra
utilizada y que el solvente que se usó no extrajo los metabolitos secundarios
en la proporción adecuada para demostrar dicha actividad a tal concentración.
A comparación del extracto alcohólico, las
diferentes concentraciones de aceite esencial trabajadas dio como resultado
halos de inhibición con mayor diámetro esto se debe a que en el aceite esencial
son extraídos en mayor proporción los monoterpenos provocantes de la actividad
antifúngica los cuales son el mentol y mentona dando como resultados un
crecimiento directamente proporcional de los halos de inhibición, es decir a
mayor concentración, mayor diámetros de halos de inhibición y mayor efecto
antifúngico.
En general, nuestro trabajo de investigación está
en consonancia con las investigaciones realizadas por Tullio Vivian et al. en
el año 2019 en su estudio “Evaluación de la actividad antifúngica del aceite
esencial de Mentha piperita (Lamiaceae) y su interacción sinérgica con
los azoles” en donde se demostró que el aceite esencial ejerce actividad
fungicida contra levaduras del género Malassezia, estableciendo que
puede servir para el tratamiento en afecciones como la caspa (4).
Además, en el estudio realizado por Rusenova N.
et al en el año 2016 sobre la actividad inhibitoria de doce aceites esenciales
contra algunos microorganismos mediante el método de difusión por disco
concuerdan con el estudio realizado actualmente, probando que el aceite
esencial de Mentha piperita posee actividad antifúngica a
concentraciones de 2 a 0,008% (v/v) (6).
Por otra parte, Lee Min Young et al. en el año
2018 realizaron una investigación in vitro con la finalidad de evaluar el
efecto de diferentes extractos alcohólicos y aceites esenciales naturales
frente al género de Malassezia obteniendo como resultado que los agentes
de lavanda y cidra fueron relativamente menor que los de la Mentha piperita en
MIC, MFC y método de difusión de disco, llegando así a la conclusión que tantos
los extractos alcohólicos como aceite esencial son eficaces para suprimir la
actividad de Malassezia furfur causante de la dermatitis seborreica (7).
El estudio demuestra que las mejores
concentraciones en el caso del aceite esencial de menta son a partir de 10500
ppm y 12500 ppm y es la mejor opción antes que las concentraciones de extracto
alcohólico debido a que en la escala de Duraffourd éstas presentan sensibilidad
media, además que en el tipo de muestra y método de extracción utilizado es el
indicado para obtener en mayor proporción los monoterpenos responsables de la
actividad antifúngica contra Malassezia furfur.
CONCLUSIONES
Se determinó la actividad antifúngica del aceite
esencial de las hojas de M. piperita en diferentes concentraciones, siendo
2500, 4500, 6500 y 8500 ppm medianamente sensible con halos de inhibición de 9
a 14mm, mientras que para 10500 y 12500 ppm la sensibilidad fue mayor con halos
de inhibición a partir de 15 mm.
Se evaluó el efecto antifúngico del extracto
alcohólico de la hoja Mentha piperita en diferentes concentraciones, siendo
50000 ppm la de mayor sensibilidad con un halo de inhibición de 13 mm mientras
que la concentración de 5000 ppm presentó sensibilidad nula.
Se definió estadísticamente que el aceite
esencial presentó mayor efecto antifúngico a concentraciones de 10500 a 12500
ppm con halos de inhibición de 15 mm ± de 0.58 mientras que el extracto
alcohólico presentó mayor sensibilidad en concentración de 50000 ppm con halos
de inhibición de 13 mm ± 0.00 rechazando nuestra hipótesis nula sobre la
igualdad de las medias entrelos dos grupos (aceite esencial y extracto
alcohólico).
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