REVISTA "INGENIERÍA QUÍMICA Y DESARROLLO"

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

DE BACTERIAS FERMENTADORAS TIPO

ZYMOMONAS MOBILIS, MEDIANTE LA DETECCIÓN

DEL GEN PDC Y SECUENCIACIÓN DE LOS GENES

16SRDNA Y RPOB.

ISOLATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF FERMENTING BACTERIA ZYMOMONAS MOBILIS TYPE, BY DE-

TECTING THE PDC GENE AND GENE SEQUENCING 15SRDNA AND RPOB.

Carlos Alberto Muñoz Cajiao,

Ing. Químico

Programa de Biotecnología, Biología Molecular e Ingeniería Genética,

Universidad de Guayaquil, ciudadela Salvador Allende, Av. Kennedy y Av.

Delta. Facultad de Ciencias Médicas. Teléfono 2281665 Guayaquil, Ecuador

email: dakarube@hotmail.com

RESUMEN

El presente trabajo se basa en la identificación y caracterización molecular de los genes pdc (piruvato

decarboxilasa), impulsores en la producción de alcohol etílico que se encuentran en las cepas aisladas

de las bacterias Zymomonas mobilis, obtenidas del agave, que es un lixiviado de la planta cabuya,

de la Provincia del Tungurahua, Ecuador. Para este fin, se hizo uso de la secuenciación de los genes

16 SrDNA y rpoB. Para la caracterización de las cepas aisladas mediante técnicas de cultivo, se empleó

iniciadores universales del gen 16S del ARN ribosómico (16S rRNAF/R) y del gen de la ARN polimerasa

dependiente de ADN (rpoßF/R). Para confirmar si las cepas aisladas correspondían al género Zymomo-

nas se secuenciaron los productos de amplificación obtenidos con los iniciadores 16SrRNA514F/805R;

rpoß 2041F/2063F/3202R; y pdcfw1/RV1 respectivamente. Con la ayuda del GenBank se pudo de-

terminar que la secuencia obtenida correspondía al gen pdc de la bacteria Zymomonas mobilis.

PALABRAS CLAVES: genes pdc, 16SrDNA, rpoB y Zymomonas mobilis.

ABSTRACTS

The present paper is based on pdc (piruvato decarboxilasa) genes molecular characterization

and identification, promoters in ethylic alcohol yield, found in Zymomonas mobilis bacterias

isolated stream obtained them from agave that is a lixiviatic fluid of cabuya plant, provincial del

Tungurahua, Ecuador. In order to obtain this proposal, it was used 16SrDNA y rpoB genes sequencing. To

Characterization of isolated strains by culture thecniques, It was used ADN (rpoßF/R)genes and ADN’

depending ARN polimerase (rpoßF/R) universal initiators. To confirm if isolated strains belongs to

Lymomonas mobilis type, amplified samples (amplicon) obtained with initiators 16SrRNA514F/805R;

rpoß2041F/2063F/3202R and pdc fw1/RV1 were senquenced, respectively. By online Genbank assistance

it could determined that obtained sequence corresponded to Zymomonas mobilis bacteria pdc genes.

KEY WORDS: pdc, 16SrDNA, rpoB y Zymomonas mobilis genes.

Recibido 24 Octubre/2014. - Aceptado 18 Diciembre/2014

Publicado como artículo científico. Revista Ingeniería Química y Desarrollo 2015 1(1)

No 1, Enero - Junio 2015 pp. 23 - 28

ISSN 1390 – 9428

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INTRODUCCIÓN

En la actualidad el interés de encontrar

fuentes sustitutas de energía ha llevado a

investigar nuevas alternativas que han con-

fluido en la generación del biocombustible.

Los biocombustibles se presentan como una

alternativa a los combustibles fósiles de-

bido a su carácter renovable y a su menor

impacto ambiental. De entre ellos, el eta-

nol es uno de los combustibles alternativos

con mayor crecimiento en producción en los

últimos años (Ames J., Werner C., 2003).

La mayoría del etanol producido en la ac-

tualidad deriva de la fermentación de azú-

cares fácilmente extraíbles de los cerea-

les (maíz, cebada, etc.), caña de azúcar y

otras fuentes azucaradas. Recientemen-

te se ha comenzado a cuestionar la pro-

ducción de etanol a partir de estos vege-

tales ya que podría alterar el ecosistema.

Para evitar estos inconvenientes se están

realizando investigaciones con el fin de en-

contrar fuentes naturales alternativas para

la producción de etanol mediante la utiliza-

ción de microorganismos. De entre las fuen-

tes naturales alternativas para la produc-

ción de etanol, la biomasa lignocelulósica

aparece como una de las más adecuadas.

La biomasa lignocelulósica incluye resi-

duos forestales y agroindustriales (serrines,

restos molienda, fabricación papel, etc.).

Dentro de los principales microorganismos

responsables de la fermentación en la produc-

ción de alcohol se encuentran las levaduras,

mohos y bacterias, cada uno de estos microor-

ganismos posee una característica propia so-

bre la fermentación que es capaz de provocar.

Una de las características de las bacterias del

género Zymomonas no necesitan ser inmovi-

lizadas para tener eficacias de fermentación

alta. (Kim Ch. et al., 1992) Aunque la misma

no puede ser empleada para la fermentación

alcohólica de cerveza o sidra, debido a que

produce sabores y olores desagradables.

No obstante posee una alta resistencia a so-

brevivir a concentraciones elevadas de eta-

nol, lo que la convierte en una bacteria ideal

en la generación de etanol para usos no co-

mestibles, como son los biocombustibles.

La presente investigación fue enfocada en el

aislamiento y caracterización molecular de

bacterias fermentadoras tipo Zymomonas

mobilis, mediante la detección del gen pdc y

secuenciación de los genes 16SrDNA y rpoß

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestra

El aislamiento de las cepas de Zymomonas

mobilis fueron obtenidas del laboratorio de la

Facultad de Ingeniería Química, cedidas por los

Ing. Ricardo Abarca Araúz y Verónica Navarrete.

Muestra control

La cepa de Zymomonas mobilis subsp. mo-

bilis E-82099 utilizada en este estudio como

control positivo, fue adquirida a VTT Cul-

ture Collection, Finlandia. La cepa utiliza-

da fue cultivada en caldo PYG (cantidades

en gr/L: Glucosa 10, Extracto de levadura

2.5, Peptona 5, pH= 6.8) a 30°C durante

72 horas permitiendo la reactivación bac-

teriana y luego sub-cultivarla en caldo PYG

y volverla a congelar a -80°C en presencia

de 15% de glicerol para su conservación.

Extracción de ADN

Para la extracción de ADN se utilizó el método

de CTAB (Underwood SA, et al., 2002), como

sigue: 3 ml de cultivo bacteriano fueron cen-

trifugados a 10,000 rpm durante 1 minu-

to hasta obtener un sedimento del cultivo.

Luego se descartó el sobrenadante y se le sus-

pendió en 567 µl de solución de lavado 1 más

30 µl de solución de lisis, homogenizándose por

vórtex hasta obtener una suspensión homo-

génea, luego se adicionó 3 µl de Proteinasa K,

homogenizándose e incubo a 37°C por 1 hora.

Una vez concluido el tiempo de in-

cubación se adicionó 100 µl de solu-

ción de lisis 2 y mezclo nuevamente.

De ahí se añadió 80 µl de solución de lisis 3

(previamente calentada a 65°C) para incu-

bar nuevamente a 65°C por 10 min., luego

de esto se incubo con 1 µl de ARNasa por

1hora a 37°C para la degradación del ARN

contaminante en la extracción, a continua-

ción se añadió 1 volumen de la mezcla de la

solución de purificación 2a y 2b (propor-

ción 24:1), se homogenizó durante 2 minu-

tos hasta formar una emulsión y centrifugó

a 12,000 rpm por 5min, transfiriéndo-

se la fase superior (500 µl) a un nuevo

tubo y se añadió 250 µl de solución de

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purificación 1 con 250 µl de la mezcla de la solu-

ción de purificación 2a y 2b (proporción 24:1),

homogenizar durante 2 minutos hasta formar

una emulsión y nuevamente se centrifugo

12000 rpm 5 min., transfiriéndose 400 µl de

la fase superior a un nuevo tubo al cual se

le adicionó para precipitar el ADN 0,6 vol.

De la solución de precipitación enfriada (240

µl) incubándose por 20 min a -20°C lue-

go se centrifugo a velocidad máxima por 5

min., se eliminó el sobrenadante y se lavó

el pellet con 1000 µl de solución de lavado

2, se volvió a centrifugar por 5 min., elimi-

nándose el sobrenadante y se dejó secar

por 15 min. a temperatura ambiente para

luego re suspender el pellet en 50 µl de re

suspensión previamente calentada a 65°C.

Luego de la extracción, al ADN se le midió la

concentración y pureza empleando un Biofo-

tómetro marca Eppendorf mediante la medi-

ción de la absorbancia de la muestra de ADN

extraído diluyendo 1 µl de la muestra extraí-

da en 59 µl de la Solución de re suspensión.

Diseño de iniciadores para el gen

piruvato decarboxilasa (pdc)

Los iniciadores fueron elaborados con la ayu-

da del software online Primer3 teniendo en

cuenta las características estándar de diseño

(200-500 nt; temperatura de 50-60°C, 40-

80%GC) a partir de las secuencias del gen

PDC (número de accesión: M20667.1) de un

alineamiento múltiple en los programa MEGA

5 y ClustalW (on-line) de 25 secuencias de

organismos diferentes que presentan el gen

PDC (G. Huerta-Beristain, et al, 2004) con

lo cual se permitió diferenciar Zymomonas

mobilis de otros organismos que contenían

el gen PDC (Alan D. Neale, et al., 1987).

De las secuencias diseñadas se evaluó su

especificidad mediante el programa on-line

Blast frente a la base mundial de secuencias.

Caracterización molecular de las

colonias aisladas.

A partir del ADN extraído de las colonias (A

y B) aisladas de las muestras de pulque, se

procedió a amplificar y secuenciar los genes

PDC, 16S rRNA y rpoß empleando los ini-

ciadores pdcfw1/RV1, 16SrRNA514F/805R

y rpoß 2041F/2063F/3202R, respectiva-

mente (Case RI, Boucher Y, et al., 2007)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Diseño de los iniciadores

Para el diseño de iniciadores se alinearon 25

secuencias de organismos que contienen el

gen PDC (Tabla N°.1), observándose que el

gen PDC de Zymomonas mobilis presenta una

homología de: 68% y 51% con los procario-

tas Zymobacter palmae y Sarcina ventriculi,

respectivamente; un 95%, 64%, 55%, 53%,

51%, 49% con las levaduras Pichia jadinii,

Schizosaccharomyces pombe, Saccharomy-

ces cerevisae, Pichia pastoris, Candida tropi-

calis y Candida dubliniensis respectivamente;

un 53% y 52% con los hongos basidomyce-

tos Laccaria bicolor, Coprinopsis cinérea, res-

pectivamente; un 52%, 51%, 54%, 53%,

54%, y 51% con los hongos ascomicetos As-

pergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Neo-

sartorya fisheri, Paracoccidioides brasiliensis,

Ajellomyces capsulatus, Penicillium marne-

ffei, , respectivamente; y con las plantas Pi-

sum sativum, Ricinus communis y Nicotiana

tabacum 56%,52% y 54%, respectivamente.

Observando que la secuencia del gen PDC

de Zymomonas mobilis muestra gran di-

ferencia con las secuencias del gen PDC

publicado en diferentes estudios perte-

necientes a otros organismos y los inicia-

dores desarrollados presentaron homo-

logía del 95-100% con 6 secuencias de

Zymomonas mobilis publicadas. (Tabla No.1)

Permitiendo así diseñar iniciadores que am-

plificaban una región del gen PDC, de los

cuales los iniciadores pdcfw1/pdcVR1 fue-

ron los que mejores condiciones termo-

dinámicas presentaban logrando obtener un

fragmento de 666 pb, los mismos pre-

sentaron una homología y cobertura del

100% con secuencias del gen PDC de Zy-

momonas mobilis (números de accesión:

HM235920, AE008692, CP001722,

AB359063, M15393, X59558, AF124349

M15368, M20667) y permitía diferen-

ciarla de otras secuencias de genes PDC.

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Tabla No. 1.- Alineamiento múltiple de 25 organismos empleados para el desarrollo de iniciadores especi-

ficos de Zymomonas mobilis para amplificación del gen pdc. Se incluye listado de secuencias, número de

accesión y porcentaje de similaridad de organismos alineados para el diseño de iniciadores específicos de

Zymomonas mobilis para de detección del gen pdc.

N° organismo

Número de accesión

Nombre científico

% de similaridad

AF474145

Zymobacter palmae

68%

AF354297

Sarcina ventriculi

51%

AB489119

Pichia jadinii

95%

NM_001018196

Schizosaccharomyces pombe

64%

NM_001182021

Saccharomyces cerevisiae

55%

XM_002492352

Pichia pastoris

53%

XM_002545405

Candida tropicalis

51%

XM_002420203

Candida dubliniensis

49%

XM_001875854

Laccaria bicolor

53%

XM_001835619

Coprinopsis cinérea

52%

XM_002374626

Aspergillus flavus

52%

XM_726388

Aspergillus fumigatus

51%

XM_001257350

Neosartorya fischeri

54%

XM_002795760

Paracoccidioides brasiliensis

53%

XM_001542350

Ajellomyces capsulatus

54%

XM_002143931

Penicillium marneffei

51%

Z66543

Pisum sativum

56%

XM_002514599

Ricinus communis

52%

X81854

Nicotiana tabacum

54%

M15393

Zymomonas mobilis

95%

AB359063

Zymomonas mobilis

95%

M15368

Zymomonas mobilis

95%

M20667

Zymomonas mobilis

100%

X59558

Zymomonas mobilis

95%

AF124349

Zymomonas mobilis ZM4

98%

Fuente: Elaboración propia

Extracción de ADN

El protocolo de extracción utilizando el kit

proporcionado por el proveedor permitió

la obtención de ADN de buena calidad, de-

bido al empleo de pasos de purificación in-

cluidos. Esto permitió que para las pruebas

posteriores tener un ADN de óptima calidad.

Se pudo obtener 142 µgr/ml de ADN con

pureza de 1.88 a partir de un cultivo bac-

teriano con una densidad óptica de 0.5, lo

cual estaba dentro de los rangos óptimos

para considerarse como una buena extrac-

ción. Adicionalmente el ADN extraído mi-

grado en un gel de agarosa al 1% mostró una

buena calidad del mismo (Figura 1).

Reacción en cadena de la polimerasa

Los iniciadores utilizados en el estudio, así

como para las pruebas de sensibilidad y es-

pecificidad estaban dirigidos hacia una re-

gión de 666 pb. (Figura 2), de la secuen-

cia del gen pdc de Zymomonas mobilis,

gen esencial en el proceso de obtención

de etanol a partir de soluciones azucaras,

Figura 1.- Migración en gel de agarosa al 1% de

ADN extraído mediante protocolo de CTAB. 1-2:

ADN cepa B; 3-4: ADN cepa A; 5-6: Cepa control;

C-: control negativo.

Figura 2.- Resultados de amplificación median-

te PCR de muestras positivas de Zymomonas

mobilis. MPM: Marcador de Peso Molecular; 1-2

muestra colonia A, 3 muestra colonia B; 4 control

negativo; 5-6 controles positivos (cepa control de

Zymomonas mobilis)

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las condiciones de amplificación fueron

estandarizados para ser empleados en

una prueba de PCR con una temperatu-

ra de hibridación de 57°C, lo cual permi-

tió obtener amplificación con la colonia A,

mientras que de la colonia B no se pudo

obtener amplificación con estos iniciadores.

Prueba de Sensibilidad

A partir de 540 µg/ml de ADN extraído se

realizó las diluciones seriadas (factor 10)

desde el tubo inicial (540 µg/ml) hasta una

dilución 10-7 (54 pg/ml). En el análisis por

PCR de las diluciones sucesivas realizadas

a partir del ADN inicial extraído hasta una

dilución 10-7 En el análisis por PCR de las

diluciones sucesivas realizadas a partir del

ADN inicial extraído hasta una dilución 10-7

se observa que la PCR es capaz de detec-

tar hasta una dilución 10-5 (5.4 ng/ml; 5.4

pg/µl, no observable en la foto). Todos los

productos obtenidos de las amplificaciones

tuvieron el tamaño correspondiente aproxi-

mado para el fragmento que amplificarían los

iniciadores pdcfw1/Revi, dando un fragmen-

to de aproximadamente 666 pb. (Figura 3).

Prueba de Especificidad

Con el objeto de verificar que los iniciado-

res pdcfw1/VR1 solo detectaban las cepas de

Zymomonas se procedió a evaluar su espe-

cificidad. Luego de haber realizado el alinea-

miento múltiple y observado que los iniciado-

res no detectarían ninguna de las secuencias

alineadas con anterioridad debido a que las

secuencias de Zymomonas mantenían una

Similitud promedio con hongos del 52%, con

levaduras en un 61% dentro de las cuales la

más cercana era Pichia jadinii (95%) y que se

asemejaba solo en un 55% con su prin-

cipal organismo competidor etanologenico

Saccharomyces cerevisae esto permitió el

diseño de iniciadores específicos de especie

Para las pruebas de especificidad se evalua-

ron 5 cepas de bacterias para determinar la

especificidad de los iniciadores pdcfw1/Rev1,

con lo cual en 4 cepas evaluadas no se ob-

tuvo amplificación, mientras que se obtuvo

amplificación en una cepa de Escherichia coli

(E. coli) (aproximadamente 300 pb.), así

como en las cepas de Zymomonas utilizadas

como control positivo en las cuales se obtu-

vo el respectivo producto amplificado del ta-

maño esperado (666 pb. aprox.). (Figura 4)

Figura 3.- Resultados de amplificaciones con los

iniciadores pdcfw1/rv1 en diluciones sucesivas

para determinar la sensibilidad de la prueba.

MPM: Marcador de peso molecular 1: dilución

10-1; 2:dilución 10-2; 3 dilución 10-3; 4 dilución

10-4; 5 dilución 10-5; 6 dilución 10-6; 7 dilución

10-7; 8-9 control negativo

Figura 4.- Resultados de prueba de especificidad

de los iniciadores pdcfw1 / rv1. MPM: Marcador

de peso molecular; 1: Vibrio cholerae; 2: Shigella

sp.;3: Salmonella entérica; 4: Escherichia coli; 5-6

Zymomonas mobilis; 7: Estreptococos sp.; 8-9

control negativo.

CONCLUSIONES

La PCR es considerada como uno de los mé-

todos más sensibles para la detección de

microorganismos que se encuentran presen-

tes en pequeñas concentraciones y que no

pueden ser detectados mediante técnicas de

cultivo convencionales. Aunque la PCR puede

ser utilizada sobre muestras medioambienta-

les, los mejores resultados se obtienen a par-

tir de cultivos puros, esto debido al sin núme-

ro de compuestos inhibidores de la actividad

de polimerización de la Taq. ADN polimerasa.

El método de extracción de ADN con

CTAB proporciona un ADN de buena ca-

lidad que puede ser utilizado en pruebas

moleculares que necesiten ADN de ex-

trema pureza, debido al empleo de com-

ponentes que permiten eliminar contami-

nantes durante las etapas de la extracción.

Los iniciadores desarrollados para la detec-

ción del gen pdc permitían una correcta detec-

ción del mismo dentro de las cepas aisladas

del medio ambiente como en la cepa control.

Para una correcta identificación de cepas

bacterianas la amplificación y secuenciación

de genes universales blanco como son el gen

16S rRNA, rpoß y del gen mismo gen pdc son

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necesarias ya que permiten confir-

mar los resultados obtenidos me-

diante técnicas convencionales.

De acuerdo a los resultados la secuen-

ciación de estos tres genes permitió

confirmar la presencia del género Zy-

momonas en los aislados obteniéndose simi-

litudes de 86%, 100% y 100% para los ge-

nes 16S rRNA, rpoß y PDC respectivamente.

En el análisis de sensibilidad de la téc-

nica de amplificación sin necesidad de

pre-enriquecimiento de la muestra se ob-

serva que la sensibilidad de detección es

de 5,4 ng/ml de ADN extraído después

de 5 hrs. de cultivo y un OD de 0.4 (can-

tidad de colonias aproximada de 8x107),

lo cual con un mayor tiempo de cultivo has-

ta alcanzar una OD de 0.5 o más permitiría

un mayor nivel de sensibilidad de la prueba.

Debido a la gran similitud con genes rela-

cionados en otras especies etanologénicas y

su interés de poder por ingeniería genética

modificar otras cepas bacterianas para que

sean capaces de producir alcohol que pueda

ser empleado como carburante, es necesa-

rio la búsqueda e implementación de técni-

cas que permitan la detección de otros genes

que son de gran importancia en el proceso

tanto de producción de alcohol como en la

capacidad de poder soportar otros sustratos

que naturalmente Zymomonas no es capaz

de degradar para convertirlo en materia pri-

ma en el proceso de producción de alcohol.

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